流體環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)影響RNA-binding protein quaking(QKI)表達(dá)
內(nèi)皮層的細(xì)胞與細(xì)胞間的聯(lián)系對于其發(fā)揮正常的生理作用有非常重要的作用。細(xì)胞間聯(lián)系不僅會影響包括囊泡的釋放和白血球滲出，并進(jìn)一步影響血管生成過程。荷蘭的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RNA-binding protein quaking(QKI)表達(dá)收到流動狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的影響。流動刺激下，其表達(dá)時間變長，并且轉(zhuǎn)錄因子KLF2會結(jié)合到其啟動子上。進(jìn)一步，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)quaking會直接和VE-cadherin和β-cadherin的mRNA相結(jié)合，并且能通過3’UTR直接誘導(dǎo)mRNA的翻譯。
科學(xué)家們將HUVECs種在通道載玻片上，并且為其提供10dyne/cm2的持續(xù)的剪切力，進(jìn)行長達(dá)7天的培養(yǎng)。之后，科學(xué)家們分析流體剪切力處理后的細(xì)胞表達(dá)的RNA并且直接對其進(jìn)行免疫熒光染色。
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1）細(xì)胞： HUVECs
2）試劑： 3.7% formalin （Millipore）
0.5% Triton X-100 （Sigma-Aldrich)
Hank’s Balanced Salt Solution containing Ca2+ and Mg2+ （HBSS Gibco）
3）培養(yǎng)耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI0.4 Luer （ibidi，Germany，80606）
灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
串聯(lián)管（ibidi，Germany，10830）
封口夾
4）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）
二、實(shí)驗(yàn)方法
在實(shí)驗(yàn)開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
一）培養(yǎng)細(xì)胞
準(zhǔn)備HUVECs，按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。盡量使用比較健康的內(nèi)皮細(xì)胞，以防在做流體實(shí)驗(yàn)時候細(xì)胞不能穩(wěn)定貼壁。
按照下面流程鋪細(xì)胞：
1）按細(xì)胞密度為1.5* 10 6 cell/ml 鋪細(xì)胞，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個通道。
2）蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基。
3）將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)3小時左右，等到細(xì)胞剛剛長滿為單細(xì)胞層，即可開始實(shí)驗(yàn)。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個細(xì)胞均受到均勻的剪切力。
二）搭建流體系統(tǒng)
1）將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中分別加入8ml培養(yǎng)基。這時不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。
（表一）
2）連接通道載玻片。使用串聯(lián)管，將通道串聯(lián)起來。這樣可以在同一個條件，同一種液體的刺激下培養(yǎng)不同的樣本。
在細(xì)胞貼壁后，將串聯(lián)管如如圖示插入串聯(lián)管
在每一個注液孔中加滿培養(yǎng)基，要注意不能把氣泡加入在注液孔中。
用1ml的無菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。
小心推入培養(yǎng)基，直到第一個串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出。
小心的將串聯(lián)管彎過來，插入相鄰的注液孔中。不要產(chǎn)生氣泡。
繼續(xù)推動注射器，直到第二根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動注射器充滿下一根串聯(lián)管。
重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。
將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。
小心將灌流管的一個魯爾接頭從聯(lián)通管中拔出，插入末尾一個注液孔中。
小心將注射器移除，在注液孔中加滿培養(yǎng)基，將灌流管的另一個接頭插入。
串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。
3）流體剪切力實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞受到穩(wěn)定的10dyne/cm2 刺激。持續(xù)培養(yǎng)7天，并在第一天和第四天更換全部培養(yǎng)液。整個系統(tǒng)一直置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)好的細(xì)胞用3.7% formalin固定10分鐘并用Triton X-100通透2分鐘。在使用含1%BSA和HBSS溶液封閉1小時后分別加入一抗二抗染色。
三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在流體剪切力刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞中OKI上調(diào)表達(dá)。如圖所示，a)RT-PCR 檢測的在靜置培養(yǎng)和流動培養(yǎng)的HUVEC中提取的Klf2和Nos3的mRNA的量。b）免疫熒光染色顯示兩種培養(yǎng)條件下HUVEC中的NOS3（綠色）或 VE-cadherin（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）或F-actin（紅色）。c）兩種培養(yǎng)條件下HUVEC細(xì)胞中 Qki5，Qki6和Qki7的RT-PCR結(jié)果。d）兩種培養(yǎng)條件HUVEC中提取的蛋白的免疫印跡對比。e) 兩種培養(yǎng)條件下HUVEC細(xì)胞中 Qki5，Qki6和Qki7的免疫熒光（綠色）檢測結(jié)果。
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