最近高分辨率成像技術的發展使研究人員能夠通過使用免疫熒光染色在其感興趣的細胞和組織中可視化亞微米級甚至納米級結構。然而，這需要在樣品制備過程中進行仔細對步驟進行優化，以便獲得清晰的圖像，并且隨著圖像分辨率的提高，方案可能會變得更加苛刻。
 

盡管各種抗體制造商都提供了“最佳”方案，但遺憾的是沒有可應用于所有樣品類型的標準程序。事實上，大多數時候，研究人員需要通過反復試驗找到最佳工作流程。

理論上，免疫熒光染色方案包括以下六個基本步驟：固定-透化-封閉-一抗孵育-二抗孵育以及圖像采集。然而，在每一步都有許多小細節：當以一種或另一種方式完成時，可決定您是否獲得良好的免疫熒光圖像或糟糕的圖像。
 

來自 Lewis 大鼠的骨髓間充質干細胞用抗兔 PCNA 抗體（以洋紅色顯示）、抗 α-微管蛋白抗體（以綠色顯示）和鬼筆環肽（以紅熱顯示）染色。使用 Leica SP8 共聚焦顯微鏡獲取圖像。

自2017年作為理學碩士學生進入研究環境以來，我一直在研究各種類型的間充質干細胞和胚胎組織，研究顱面再生和發育。此外，我一直沉浸在免疫熒光染色的世界中，拍攝了無數圖像，包括我的第一篇出版物（Yamada et al., 2019）《牙科研究雜志》的封面藝術。在每年花費近300小時進行熒光成像后，我發現了適合我的細胞和應用的完美免疫熒光方案。我了解到，這里和那里的一些小調整真的會有所作為！

在本文中，我將分享我的前5個基本但經常被忽視的優化步驟，這些步驟將改善您的免疫熒光細胞圖像。

　　1. 了解您的目標蛋白并確定固定方案

首先要考慮的關鍵因素是決定為您的樣品使用哪種固定劑。各種固定劑，包括醛類（例如，多聚甲醛：PFA）、酒精（例如，冰冷的甲醇）和酸基溶液（例如，三氯乙酸）已顯示出與免疫熒光出色的相容性，但是這些固定劑中的每一種都有其優點和缺點。PFA和甲醇是很好的選擇。您可以在文獻中了解它們在固定特性方面的差異（例如Eldred et al., 1983）。

無論您選擇哪種固定劑，優化固定時間至關重要。應避免過度固定，因為它會對細胞造成破壞性影響并惡化抗體識別（圖 1A）。然而，人們也應該避免固定不足，因為它允許您的靶向蛋白質從其天然位點移動并擴散到“外部世界”。這不僅會導致模糊圖像，還會導致假陽性染色。

時間很重要，溫度同樣也很重要。低溫使反應緩慢且對細胞的破壞性較小，但它可能使蛋白質有時候在被固定之前四處移動。通常，當使用強效/速效固定劑（如冰冷的甲醇）時，優選在低溫下固定。對于較溫和的固定劑，如PFA，在環境溫度下固定可能更合適，至少對于單層細胞。

我曾經盲目地遵循“4% PFA 室溫 15 分鐘”的規則，但后來我發現我的樣品固定不足，浪費了很多時間和資源。這可能不會經常發生，但它會發生。如有疑問，請仔細檢查您的固定方案！

圖 1A：過度固定的示例。甲醇在室溫下使用 15 分鐘。紅色和細胞核中的α-微管蛋白，藍色的 DAPI

圖 1B：正確固定細胞的示例： -20 度冰冷的甲醇 5 分鐘。紅色的 α-微管蛋白和藍色的細胞核 *DAPI

　　2. 確定使用哪種洗滌劑以及何時使用（或不使用）

當需要透化時，非離子去污劑（例如，Triton X-100 和 Tween-20）通常不僅包含在透化緩沖液中，而且還經常包含在封閉緩沖液、洗滌緩沖液和染色緩沖液中。這是因為去污劑的使用實際上提高了封閉效率，并在洗滌步驟中去除了非特異性抗體結合。但是，如果您的靶向蛋白（尤其是在細胞膜或細胞骨架上）在您的圖像中顯示的數量低于您的預期，則洗滌劑可能會干擾免疫染色。

Triton X-100 和 Tween-20 具有不同的化學特性，但最重要的是，Triton X-100 比 Tween-20 更強大地滲透細胞膜。如果在透化步驟中使用 Triton X-100，您可以選擇是繼續在洗滌、封閉和染色緩沖液中使用 Triton X-100，還是改用 Tween-20，甚至繼續沒有任何清潔劑。或者，您可能只想使用 Tween-20 進行滲透。最后，不要忘記有時您根本不需要清潔劑。

　　3. 濃度低，但孵化時間長

使用最少量的抗體對于提高信背比極為重要。我總是建議使用抗體滴定來確定最低工作濃度，即使制造商可能會提出最佳濃度。通常，與高抗體劑量的較短孵育時間相比，低抗體濃度的較長孵育時間（例如，4°C，過夜）提供更清晰、更強和更特異性的染色模式。抗體滴定有時很費力，需要額外的資源和時間，但一旦確定了最佳工作濃度，您就不會后悔。

　　4. 洗 洗 洗

洗滌可能是免疫熒光染色過程中最重要的步驟。相信我，一個人永遠不會后悔額外的洗滌步驟！只要使用高質量的抗體，抗原-抗體結合就足夠強，可以承受“額外的”洗滌步驟，同時有效去除弱結合或非特異性結合的抗體。一個微弱的低語可能即將從你的嘴唇中發出，“它既費時又單調。”我知道，但洗滌確實讓您的形象從好到更好！多增加一兩個洗滌步驟，讓您有時間享用一杯茶。

　　5. 找到合適的光學設備

最后但并非最不重要的一點是，只有在所有光學系統都得到很好的優化后，才能捕捉到圖像中的精細細節。如果您從事攝影，您可能會意識到高端鏡頭通常比相機（例如傳感器系統）本身更昂貴。這僅僅是因為在精密玻璃和涂層的開發上花費了如此多的資源和如此多的時間。可以說，這些鏡頭的質量決定了圖像的質量。同樣的理論也適用于微觀系統。顯微鏡的光學系統是最終圖像質量的關鍵決定因素。有趣的事實：這是顯微鏡制造商為了提升他們的技術而激烈競爭的組件！

現在我能聽到你說，“我們不能改變顯微鏡的光學系統。”實際上，您可以更改某些東西，這將極大地影響成像結果，而與您的技術設備無關：用于培養或放置細胞和樣品的蓋玻片或成像室！這些由薄玻璃或塑料制成的組件對人眼是完全透明的，但它們中的每一個：光/激光通過的地方，都會顯著影響最終的成像結果，就像它們是光學系統的一部分一樣。

這就是 ibidi µ-Slides 發揮作用的地方！ ibidi µ-Slide 腔室和蓋玻片的開發具有出色的光學質量，適用于高分辨率顯微鏡，因為它們的蓋玻片底部很薄。對于細胞的標準高分辨率成像（例如，相差、共焦或 2 光子），強烈建議使用細胞培養處理 (ibiTreat) polymer版，其 No. 1.5蓋玻片厚度為 180 µm，而 µ-Slides #1.5H 玻璃底部 (170 µm +/-5 µm) 的載玻片非常適合 TIRF 和超分辨率顯微鏡應用。

在我的博士項目開始時，ibidi µ-Slides被介紹給了我，從那時起我就一直在使用它們進行 IF 實驗。如果您以前從未使用過它們，我建議您嘗試一下！