插件：在細(xì)胞接種前通過將插件/模具放置在培養(yǎng)表面，來形成無殘留的空白區(qū)域/劃痕；

　　

　　刮擦：通過刮擦表面來制造人工“劃痕“機械去除細(xì)胞（劃痕分析）

　　

　　阻抗：通過在指定區(qū)域施加電壓來去除細(xì)胞而創(chuàng)建間隙

　　

　　有關(guān)如何創(chuàng)建間隙的更多詳細(xì)信息和方法，可查看此評論：

　　

　　W.J. Ashby, A. Zijlstra. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integr Biol 2012, 10.1039/c2ib20154b

　　

　　

　　

　　ibidi提供三種不同規(guī)格的劃痕插件用于間隙的創(chuàng)建：ibidi有2孔、3孔和4孔插件（也有預(yù)置了2孔、3孔和4孔插件的培養(yǎng)皿）。由于特殊的底部（靜電黏附底部）設(shè)計，插件（生物相容硅膠材料）可粘附在培養(yǎng)器皿的表面。移除插件后，可形成無細(xì)胞殘留的空白間隙。此種方法使得在沒有任何細(xì)胞殘留的情況下，可重復(fù)地產(chǎn)生高度限定的空白間隙。

　　

　　

　　當(dāng)放置在平滑、干燥的表面上時，Culture-Insert 2 Well提供兩個用于培養(yǎng)細(xì)胞的儲液池，兩個儲液池由500μm厚的壁隔開。將細(xì)胞接種到儲液池中并培養(yǎng)直至細(xì)胞附著并形成單層，從表面移除硅膠插件后會產(chǎn)生兩個被插件中間壁隔開的精確定義的寬度完全相同的細(xì)胞區(qū)塊。現(xiàn)在可以通過使用活細(xì)胞成像或在不同時間點拍攝照片來監(jiān)測細(xì)胞遷移。

　　

　　

　　Culture -Insert 3 Well提供三個細(xì)胞培養(yǎng)池。可創(chuàng)建兩個各500 µm的無細(xì)胞間隙，因此適合分析兩個技術(shù)重復(fù)或不同細(xì)胞類型的遷移。

　　

　　

　　Culture -Insert 4 Well提供四個細(xì)胞培養(yǎng)池。除了四個500 µm無細(xì)胞間隙外，還可產(chǎn)生一個1mm的中心間隙。Culture-Insert 4 Well可最多觀察四個技術(shù)重復(fù)或不同細(xì)胞類型的遷移。

　　

　　

　　使用ibidi Culture-Insert 4 Well進行傷口愈合和遷移測定

　　

　　ibidi 3孔/4孔兩者都可以在藥物治療或基因沉默/過度表達(dá)（例如，通過 CRISPR/Cas9、siRNA、mRNA）后進行細(xì)胞遷移分析。重要的是，未經(jīng)處理的對照細(xì)胞可以在同一容器中接種和分析，共享相同的培養(yǎng)基。

　　

　　與其他間隙產(chǎn)生技術(shù)不同，ibidi劃痕插件系列產(chǎn)品還適用于2D侵襲實驗和同時使用兩種、三種甚至四種細(xì)胞類型或處理的共培養(yǎng)實驗。

　　

　　

　　進行劃痕測定時，細(xì)胞會生長直至形成單層。然后，用移液管尖端或針頭手動刮擦細(xì)胞表面以產(chǎn)生傷口。通過在不同時間點拍攝照片或活細(xì)胞成像來監(jiān)測傷口閉合和細(xì)胞遷移。

　　

　　關(guān)于再現(xiàn)性，該方法有一定的缺點：

　　

　　間隙的寬度在很大程度上取決于施加到移液器尖端的壓力和其尺寸。

　　

　　刮擦?xí)圆豢蓮?fù)制的方式去除表面涂層。這改變了細(xì)胞在該區(qū)域的粘附和遷移。

　　

　　去除的細(xì)胞以不可重現(xiàn)的方式在劃痕邊緣形成活細(xì)胞和死細(xì)胞團。活細(xì)胞的擴散會覆蓋遷移的速度。

　　

　　

　　乍一看，槍刮和放置插件的方法似乎是兩種非常相似的創(chuàng)建無細(xì)胞間隙的方法。然而，仔細(xì)觀察，這兩種方法可能在重要檢測結(jié)果方面的影響存在差異：

　　

　　

　　

　　

　　細(xì)胞遷移導(dǎo)致開放區(qū)域隨時間變化。使用ibidi Culture-Insert 2 well(左)和使用移液器吸頭刮擦(右)產(chǎn)生間隙的對比。數(shù)據(jù)來源：德國弗萊堡大學(xué)的M. Börries。

　　

　　使用阻抗的劃痕實驗

　　

　　ECIS傷口愈合實驗取代了傳統(tǒng)的劃痕實驗。ECIS System不是用移液管尖端機械地破壞細(xì)胞層，然后用顯微鏡跟蹤細(xì)胞的遷移，而是使用電信號對傷口進行監(jiān)測，然后監(jiān)測愈合過程。基于阻抗的傷口愈合實驗的優(yōu)點包括：

　　

　　•可同時進行多達(dá)96次傷口愈合實驗

　　

　　•直接推導(dǎo)時間常數(shù)和傷口愈合速度

　　

　　•經(jīng)濟高效的篩選應(yīng)用，從低通量到高通量

　　

　　

電擊傷前(左)和電擊傷后(右)的細(xì)胞層。圓圈標(biāo)記電極區(qū)域，此處細(xì)胞暴露在電中

　　

　　在與250μm電極接觸的一小群細(xì)胞上進行點擊傷，從而產(chǎn)生明確的傷口。損傷區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞密度由阻抗反映，由ECIS系統(tǒng)連續(xù)測量。受傷后，電極周圍的健康細(xì)胞立即遷移并取代電極上的死細(xì)胞，導(dǎo)致測量阻抗值的變化。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中胎牛血清(FCS)的濃度，在10、13或20小時后再次達(dá)到原始細(xì)胞密度。

　　

　　對與250µm電極接觸的少量細(xì)胞進行電損傷，從而形成明確的傷口。受傷區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞密度由阻抗反映，該阻抗由ECIS系統(tǒng)連續(xù)測量。受傷后，電極周圍的健康細(xì)胞立即遷移并替換電極上的死細(xì)胞，導(dǎo)致測量阻抗值發(fā)生變化。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中胎牛血清（FCS）的濃度，在10、13或20小時后再次達(dá)到原始細(xì)胞密度。

　　

　　

在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用不同濃度（0%、1%和10%）的FCS對時間依賴性傷口閉合進行基于阻抗的分析